ആർഎൻഎ കണ്ടെത്തലിനായി ആർടി-പിസിആർ പ്രതികരണത്തിന്റെ സംവേദനക്ഷമത എങ്ങനെ മെച്ചപ്പെടുത്താം

ജനിതക പഠനങ്ങൾ നടത്തുന്ന പ്രക്രിയയിൽ, നമുക്ക് പലപ്പോഴും വേണ്ടത്ര ആർഎൻഎ സാമ്പിളുകൾ നേരിടേണ്ടിവരുന്നു, ഉദാഹരണത്തിന്, ചെറിയ ശരീരഘടനാപരമായ ഓറൽ ട്യൂമറുകൾ, സിംഗിൾ-സെൽ സാമ്പിളുകൾ പോലും, മനുഷ്യ കോശങ്ങളിൽ വളരെ താഴ്ന്ന തലത്തിൽ പകർത്തിയ പ്രത്യേക ജീൻ മ്യൂട്ടേഷനുകളുടെ സാമ്പിളുകൾ എന്നിവ പഠിക്കാൻ.തീർച്ചയായും, COVID-19 പരിശോധനയ്ക്കായി, സ്രവങ്ങൾ ശരിയായ സ്ഥലത്ത് ഇല്ലെങ്കിലോ സാമ്പിൾ എടുക്കുമ്പോൾ മതിയായ സമയമില്ലെങ്കിലോ, സാമ്പിൾ വലുപ്പം വളരെ കുറവായിരിക്കും, അതിനാലാണ് ആരോഗ്യ, കുടുംബാസൂത്രണ കമ്മീഷൻ രണ്ട് ദിവസം മുമ്പ് പുറത്തുവന്നത്. ടെസ്റ്റ് വിജയിച്ചു, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് സാമ്പിളർ ആറ് സാമ്പിളുകൾ എടുത്തില്ലെങ്കിൽ, നിങ്ങൾക്ക് അത് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യാം.

ഞങ്ങൾക്ക് ഈ പ്രശ്‌നമോ പ്രശ്‌നമോ ഉള്ളതിനാൽ റിയാക്ടറിന്റെ സംവേദനക്ഷമത പ്രധാനമാണ്, അതിനാൽ RT-PCR-ന്റെ സംവേദനക്ഷമത മെച്ചപ്പെടുത്താൻ നമുക്ക് എന്തുചെയ്യാൻ കഴിയും?

സാധ്യമായ പരിഹാരങ്ങൾ ചർച്ച ചെയ്യുന്നതിനുമുമ്പ്, ഞങ്ങൾ സൂചിപ്പിച്ച സാഹചര്യവുമായി രണ്ട് വലിയ സങ്കീർണതകൾ പരാമർശിക്കാം.

ഒന്നാമതായി, നമ്മുടെ സാമ്പിളിൽ കുറച്ച് സെൽ പോപ്പുലേഷൻ മാത്രമുള്ളപ്പോൾ ആർഎൻഎ നഷ്ടത്തെക്കുറിച്ച് ഞങ്ങൾ ആശങ്കാകുലരാണ്.പരമ്പരാഗത വേർതിരിക്കൽ, വൃത്തിയാക്കൽ രീതികൾ, കോളം രീതി അല്ലെങ്കിൽ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് പ്രെസിപിറ്റേഷൻ രീതി എന്നിവ ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ, കുറച്ച് സാമ്പിളുകൾ നഷ്ടപ്പെടാനുള്ള ഉയർന്ന സാധ്യതയുണ്ട്.tRNA പോലെയുള്ള ഒരു കാരിയർ തന്മാത്ര ചേർക്കുന്നതാണ് ഒരു പരിഹാരം, എന്നാൽ പോലും, ഞങ്ങളുടെ വീണ്ടെടുക്കൽ പരീക്ഷണം ശരിയാണെന്നതിന് യാതൊരു ഉറപ്പുമില്ല.

അപ്പോൾ എന്താണ് നല്ല വഴി?കൾച്ചർഡ് സെല്ലുകൾക്കോ ​​മൈക്രോഅനാട്ടമിക്കൽ സാമ്പിളുകൾക്കോ ​​ഉള്ള ഒരു നല്ല ഓപ്ഷൻ ഡയറക്ട് ലിസിസ് ഉപയോഗിക്കുക എന്നതാണ്.

5 മിനിറ്റ് സെല്ലുകളെ വിഭജിക്കുക, ലായനിയിലേക്ക് ആർഎൻഎ വിടുക, തുടർന്ന് 2 മിനിറ്റ് പ്രതികരണം നിർത്തുക, തുടർന്ന് റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ റിയാക്ഷനിലേക്ക് ലൈസേറ്റ് നേരിട്ട് ചേർക്കുക, അങ്ങനെ ആർഎൻഎ നഷ്ടപ്പെടാതിരിക്കുക, ഒടുവിൽ തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന സിഡിഎൻഎ നേരിട്ട് ഇടുക. തത്സമയ പ്രതികരണത്തിലേക്ക്.

എന്നാൽ പരിമിതമായ ആരംഭ പോയിന്റ് അല്ലെങ്കിൽ ചെറിയ അളവിലുള്ള ടാർഗെറ്റ് ജീൻ എക്‌സ്‌പ്രഷൻ കാരണം, നമുക്ക് എല്ലാ ആർഎൻഎയും റീസൈക്കിൾ ചെയ്യാൻ കഴിയുമെങ്കിലും നല്ല തത്സമയ സിഗ്നൽ ലഭിക്കുന്നതിന് ആവശ്യമായ ടെംപ്ലേറ്റുകൾ നൽകിയില്ലെങ്കിൽ?

ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, പ്രീ-ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഘട്ടം വളരെ ഉപയോഗപ്രദമാകും.

റിവേഴ്സ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനുശേഷം സെൻസിറ്റിവിറ്റി വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു സ്കീമാണ് ഇനിപ്പറയുന്നത്.ആരംഭിക്കുന്നതിന് മുമ്പ്, പ്രീ-ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി ഈ ടാർഗെറ്റുകൾക്കായി നിർദ്ദിഷ്ട പ്രൈമറുകൾ രൂപകൽപ്പന ചെയ്യുന്നതിന്, ഞങ്ങൾക്ക് താൽപ്പര്യമുള്ള ടാർഗെറ്റുകൾ ഏതൊക്കെയാണെന്ന് ഞങ്ങൾ ഡൗൺസ്ട്രീം ചോദിക്കേണ്ടതുണ്ട്.

100 ജോഡി പ്രൈമറുകളുള്ള ഒരു മിക്സഡ് പ്രൈമറും 10 മുതൽ 14 തവണ വരെ പ്രതികരണ ചക്രവും സൃഷ്ടിക്കുന്നതിലൂടെ ഇത് നേടാനാകും.അതിനാൽ, ലഭിച്ച cDNA പ്രീ-ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്യുന്നതിന് ഈ ആവശ്യത്തിനായി പ്രത്യേകം രൂപകൽപ്പന ചെയ്ത ഒരു മാസ്റ്റർ മിക്സ് ആവശ്യമാണ്.

10-നും 14-നും ഇടയിൽ സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം സജ്ജീകരിക്കുന്നതിനുള്ള കാരണം, ഈ പരിമിതമായ എണ്ണം സൈക്കിളുകൾ വിവിധ ലക്ഷ്യങ്ങൾക്കിടയിൽ ക്രമരഹിതത ഉറപ്പാക്കുന്നു, ഇത് അളവ് തന്മാത്രാ വിവരങ്ങൾ ആവശ്യമുള്ള ഗവേഷകർക്ക് നിർണായകമാണ്.

പ്രീ-ആംപ്ലിഫിക്കേഷനുശേഷം, നമുക്ക് വലിയ അളവിൽ cDNA ലഭിക്കും, അതുവഴി ബാക്ക്-എൻഡിലെ ഡിറ്റക്ഷൻ സെൻസിറ്റിവിറ്റി വളരെയധികം മെച്ചപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ സാധ്യമായ ക്രമരഹിതമായ പിശകുകൾ ഇല്ലാതാക്കാൻ സാമ്പിൾ നേർപ്പിക്കുകയും ഒന്നിലധികം തത്സമയ PCR പ്രതികരണങ്ങൾ നടത്തുകയും ചെയ്യാം.